目录这要归功于二代测序平台的价值属性比较大，较容易成为行业的中坚力量。
i.基因组学和分子病理学3
ii.为什么选择新一代测序？3
iii.什么是新一代测序？4
ngs的基本流程4
多重分析4
iv.ngs方法5
靶向测序5
v.ngs在分子病理学中的应用5
肿瘤图谱分析5
液体活检分析6
遗传病筛查6
vi.结语6
vii.词汇表7
viii.参考文献7
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仅供研究使用。不得用于诊断。
i.基因组学和分子病理学
科学研究表明，许多疾病都涉及到遗传因素。多种突变已经发现与疾病风险、遗传性疾病、癌症发生和进展相关联。
如今，一些充分鉴定的基因，如her2、alk、egfr、braf和kras，已应用于分子检测程序中，而其他基因也
正不断被发现和研究。随着临床相关遗传变异的不断发现，这些信息将带来早期诊断和更具针对性的治疗。
新一代测序（ngs）是基因组检测技术上的最新突破，实现了致病突变的研究以及风险和预后的评估。1事实上，
一些领先的医院和治疗中心，如danafarber癌症研究所和梅奥诊所（mayoclinic），已经宣布计划测序“所有
患者的数百万个癌症突变。”2,3一些机构，如美国分子病理学会（amp）4、美国病理学家协会（cap）4,5、美国食
品药物监督管理局（fda）6,7，以及美国医学遗传学会（acmg）8日前发布了临床测序指南和建议。ngs的出现
正在改变分子病理学的模式，有望在未来改变诊断、治疗和药物开发。
“通过基因集或全基因组测序，我们能够观察到比非ngs方法更多的改变，而这些改变可能驱动了患者的
癌症，因此检测的范围更广，但价格更低，周期更快。”
——华盛顿大学医学院mcdonnell基因组研究所联合主管elainemardis博士
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ngs技术的不断采用，以及测序标准整合到实验室中，反映了病理学界致力于让分子检测成为常规临床实践中不
可缺少的一部分。技术进步使得更多的小型科研和实验室能接触到测序，而使用便捷的台式仪器也不再需要训练
有素的测序专家。随着领先的研究人员、医学专家和监管机构的认可，ngs正成为一种打造人类健康未来的广为
流行的技术。
“随着[大规模并行测序]仪器不断推动转化研究的进步，更多的实验室将采用这种技术，趋势已不可阻挡，
而我们无疑也会等到这一天，新一代测序成整合进入标准的医疗流程。”
——facmgfcapjohntenbosch博士和waynegrody博士
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ii.为什么选择新一代测序？
与sanger测序、pcr扩增子检测和单基因分析等传统方法相比，ngs带来了新的优势。反复的单基因检测是一
个费时费力又昂贵的过程，有时不能获得答案，还需要后续检测。这种连续检测可能受到组织样本量的限制，甚
至需要额外的活检。相比之下，ngs可在单次实验中分析多个基因和多个样本，大大缩短了出结果的时间。有了
基因集，最重要的基因被同时评估，在很大程度上避免了后续检测的需要。此外，ngs带来了高灵敏度，可以检
测肿瘤样本中低至5%的dna中存在的突变。即使是降解的样本，如福尔马林固定石蜡包埋（ffpe）的肿瘤组织，
也能够测序，而只需要很少量dna。
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仅供研究使用。不得用于诊断。
iii.什么是新一代测序？
从原理上说，ngs技术的概念与sanger测序相似。在dna合成循环中，dna聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入
dna模板。在每个循环中，核苷酸是通过荧光标记而被识别的。关键的差异是，与测序单个dna片段不同，ngs
以大规模并行的方式将这个过程延伸到数百万个片段。这种方法是高度可扩展的——它适用于一组关键基因或整
个遗传密码信息的检测。
ngs的基本流程
illumina的ngs工作流程包括3个基本步骤（图1）：
1.通过创建带有5'和3'接头的dna或cdna短片段而开始测序文库的制备。对于“簇生成”，文库与流动槽表
面的寡核苷酸相连接。通过桥式扩增，每个文库片段作为一颗种子，产生一个含有数千个相同片段的克隆簇。
整个流动槽中形成了数百万至数十亿个簇。
2.接着，模板可立即用于边合成边测序（sbs）。sbs技术利用一种基于可逆终止子的专利方法，在单个碱基掺入
dna模板链时进行检测。11由于与可逆终止子结合的4种dntp在每个测序循环中都存在，天然竞争最大程度
地避免了掺入偏向性，因此与其他技术相比大大降低了原始错误率。12,13其结果是高度准确的碱基依次测序，即
使是在重复区域和均聚物中，也几乎避免了序列背景特异的错误。
3.然后，新鉴定出的序列被导出到输出文件，并通过序列比对软件与参考基因组进行比对。分析和报告软件指示
变异是否存在。
关于sbs测序技术的细节动画，请访问www.illumina.com/sbsvideo。
图1：ngs工作流程-illuminangs工作流程包括3个基本步骤：文库制备、测序和数据分析。
*研究模式下运行。
多重分析
多重分析允许大量或大批样本合并起来，在单个测序运行中同时测序。对于多重分析的样本，在文库制备的过程
中在每条dna模板上添加独特的索引序列，使得每条序列都能在最终的数据分析之前被识别和分类。这大大缩短
了多样本研究获得数据的时间，让研究人员能够比以往更快、更轻松地从实验到答案。
5－6小时1－2天1－2天
*
ngs文库制备试剂盒illumina测序仪器自动化的数据分析工具
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仅供研究使用。不得用于诊断。
iv.ngs方法
与传统方法相比，ngs在准确性、灵敏度和速度上有诸多优势，未来将对分子病理学领域产生重大影响。根据不
同的应用，目前有多种ngs方法，可适应不同的研究设计和目标，包括全基因组测序、外显子组测序和靶向测序
（图2）。全基因组测序确定整个dna序列，而外显子组测序只分析基因组上的编码部分。靶向测序关注感兴趣
的特定基因，是分子病理学中最常用的ngs方法。
靶向测序
利用ngs的靶向测序关注预先选择的一组已知参与疾病的基因，让所有潜在的致病基因可同时评估（图3）。靶
向基因测序带来了一些好处：
?
在单个检测中分析多个基因
?
通过减少连续检测的需求而优化有限组织样本的利用率
?
实现异质肿瘤样本中稀有变异的准确鉴定
图2：ngs方法-ngs方法包括全基因组测序、全外显子组测序和靶向测序。
v.ngs在分子病理学中的应用
靶向测序在分子病理学中的最常见应用是肿瘤图谱分析。在分析“液体活检”中的循环肿瘤dna和筛查遗传病时，
ngs方法也越来越常用。
肿瘤图谱分析
如今，分子图谱分析是肿瘤分类的标准技术，而美国病理学家协会
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和国家综合癌症网络
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也发布了指南。利用
ngs的肿瘤图谱分析关注预先选择的一组基因，目前已知它们参与了癌症的发生。这种方法适用于实体瘤和恶性
血液病，以及生殖系风险评估，以确定癌症易感性。由于这种方法聚焦有限的基因，故它能实现深度测序，带来
高灵敏度以及分析稀有变异和克隆肿瘤的能力。利用ngs的靶向测序遵循简单的流程，可轻松扩展，让实验室能
够一次处理数百个样本，更早得到答案。
全基因组测序
?最全面，完整的遗传分析
?不需要先验信息
全外显子测序
?针对编码区
?能够实现更高深度测序
靶向测序
?适用于预先选定的基因
?最灵敏的检测方法
?最简单的数据诠释
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仅供研究使用。不得用于诊断。
液体活检分析
游离的循环肿瘤dna（ctdna）可作为非侵入性的癌症标志物，替代侵入性的组织活检。如今，研究人员正研究
以ctdna作为生物标志物，检测抽血所得的液体活检中肿瘤的存在。15-17未来，ctdna有望作为非侵入性的方法，
以实时检测癌症、监控治疗反应、评估缓解或恶化，以及筛查疾病。ngs提供了检测血液中低水平ctdna所需的
高灵敏度和特异性。这种技术的进一步完善以及ctdna检测分析的开发有望彻底改变癌症的发现和治疗方式，从
而实现早期诊断，提高存活率，并改善癌症患者的生活质量。
遗传病筛查
对那些导致遗传病（如囊性纤维化或心脏疾病）的基因进行靶向测序，则为同时分析多个潜在致病基因提供了机会。
研究人员不仅可分析已知的致病基因，还能扩展分析，包括文献中引用的新基因或导致疾病发作的风险相关基因。
这种方法可以缩短获得答案的时间，并发现特定疾病的致病变异。
图3：靶向测序-靶向测序关注一组与所研究的疾病或表型相关的基因。这种方法带来了深度测序，使得检测灵敏度更高，实现了潜在致病突
变的准确研究。
vi.结语
过去十年中，基因组学的进步提高了疾病生物学的认知，这反过来又催生了疾病诊断和治疗的新方法。人们越来
越多地采用基于测序的方法，减少分子检测过程的时间和成本，并有望提供更具体、个性化的患者评估。这场医
疗保健的变革将使得诊断时间更短，治疗更加有效，最终挽救生命。
illumina致力于推进分子分析的工具，并与行业领导者合作，以改变医疗保健。总之，我们承诺ngs将走向广泛
的临床应用，以及患者诊断、治疗和预后的改善。
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仅供研究使用。不得用于诊断。
vii.词汇表
与测序文库中每个dna片段的5'和3'端相连的寡核苷酸。这些接头与illumina测序流动槽表面的寡核苷
酸互补。
在illumina流动槽表面发生的扩增反应。在流动槽生产过程中，它的表面包被了两种不同的寡核苷酸，
被称为“p5”和“p7”。在桥式扩增的第一步，单链测序文库被注射到流动槽中。当文库“流过”寡核苷酸草坪时，
文库中的单个分子与互补的寡核苷酸结合。当已连接片段的自由末端弯曲，与表面上另一互补寡核苷酸“搭桥”时，
启动发生了。重复的变性和延伸循环（与pcr类似）将单个分子本地扩增成数百万个独特的克隆簇。
与流动槽表面结合的模板dna的克隆分组。每个与流动槽结合的dna模板链都作为种子，通过桥式扩增来进
行克隆扩增，直到每个簇大约有1000个拷贝。流动槽上的每个簇都产生单条测序序列。例如，流动槽上10000个
簇将产生10000条序列。
包被了表面结合、接头互补的寡核苷酸的玻片。8-384个多重文库可同时测序，这取决于应用参数。
与测序文库中的片段连接的独特dna序列，用于下游的计算机分类和鉴定。带有独特索引
的文库可合并在一起，上样到测序流动槽的一个通道中，并在同一运行中测序。之后，序列可通过软件来鉴定和分类。
多个样本，每个带有独特的索引，可合并在一起，上样到同一流动槽中，在同一测序运行中同时测序。
取决于应用和所用的测序仪器，10-384个样本可合并在一起。
一般来说，序列指的是对应于样本dna的“a、t、c和g”碱基数据串。有了illumina的技术，数百万条
序列可在单次测序运行中产生。具体来说，流动槽上的每个簇产生了单条测序序列。
sbs技术利用4种荧光标记的寡核苷酸来平行测序流动槽表面的数百万至数十亿个簇。
在每个测序循环中，单个带有标记的dntp被添加到核酸链中。核酸标记作为可逆终止子用于聚合。在dntp掺入后，
通过激光激发和成像来鉴定荧光染料，然后用酶切除，允许下一轮的掺入。通过每个循环中的信号强度测定而直
接进行碱基检出。11
viii.参考文献
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接头：
桥式扩增：
簇：
流动槽：
多重分析：
索引/条形码/标签：
序列：
边合成边测序（sbs）：
illumina中国
上海办公室?电话：+86-21-60321066?传真：+86-21-60906279
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仅供研究使用。不得用于诊断。
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